Historia analizy tłuszczu
Podobnie jak oznaczanie zawartości białka i błonnika, oznaczanie zawartości tłuszczu jest ważną częścią analizy wartości odżywczej i oceny jakości żywności i pasz dla zwierząt, ponieważ tłuszcze są jednymi z najważniejszych źródeł energii dla ludzi i zwierząt. Określanie zawartości tłuszczu odgrywa jednak ważną rolę nie tylko w przemyśle spożywczym i paszowym; zawartość tłuszczu w surowcach jest również określana w przemyśle przetwórczym w celu oceny przydatności do określonych procedur przetwarzania i jako część kontroli jakości. Nawet w sektorze ochrony środowiska, zawartość tłuszczu w wodzie i ściekach jest określana w celu oceny czystości wody.
Jednak duża część tłuszczów i substancji towarzyszących tłuszczom, które muszą być analizowane, jest związana chemicznie i fizycznie. Dlatego do oznaczenia całkowitej zawartości tłuszczu konieczne jest trawienie próbki. Z biegiem czasu opracowano w tym celu różne klasyczne mokre metody chemiczne. Metody te mają zadziwiającą długowieczność. Chociaż obecnie dostępne są również nowoczesne metody szybkiego oznaczania, takie jak spektroskopia w bliskiej podczerwieni (NIR) lub magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), metody chemiczne na mokro są nadal metodami referencyjnymi w analizie tłuszczu.
Przegląd historycznego rozwoju mokrej chemicznej analizy tłuszczu
| Mineralizacja | Ekstrakcja | Ocena | Nazwa | Wprowadzenie |
|---|---|---|---|---|
| Brak | Ciało stałe-ciecz | Grawimetryczna | Soxhlet | 1879 |
| Hydroliza kwasem solnym | Ciało stałe-ciecz | Grawimetryczna | Weibull-Stoldt | 1892 |
| Hydroliza alkaliczna (amoniak) | Ciało stałe-ciecz | Grawimetryczna | Röse-Gottlieb (Mojonnier) | 1893 |
| Hydroliza kwasem siarkowym | Ciało stałe-ciecz | Grawimetryczna | Gerber | 1938 |
Ogólnie rzecz biorąc, można dokonać rozróżnienia między metodami referencyjnymi, szybkimi metodami chemicznymi i szybkimi lub drugorzędnymi metodami spektroskopowymi do oznaczania tłuszczu całkowitego lub surowego. Jednakże, klasyczne metody grawimetryczne i mokro-chemiczne są uważane za metody referencyjne.
Metody grawimetryczne i mokro-chemiczne należą do kategorii ekstrakcji ciało stałe-ciecz:
Ekstrakcja ciało stałe - ciecz
W ekstrakcji ciało stałe-ciecz, substancja lub grupa substancji jest specjalnie izolowana z mieszaniny stałej przy użyciu ciekłego rozpuszczalnika. Klasyczna ekstrakcja na gorąco, w której próbka jest przenoszona do rękawa celulozowego, a następnie umieszczana we wrzącym rozpuszczalniku, była pierwszą tego rodzaju ekstrakcją. Jednak całkowita ekstrakcja próbki nie jest zwykle możliwa w przypadku ekstrakcji na gorąco ze względu na równowagę między rozpuszczalnikiem a próbką. Ponieważ przepisy i normy obowiązujące w przemyśle spożywczym i paszowym stawały się z czasem coraz bardziej rygorystyczne, zainteresowanie bardziej precyzyjnymi i skutecznymi metodami ekstrakcji tłuszczu stale rosło. W związku z tym, klasyczna ekstrakcja na gorąco była coraz bardziej rozwijana, co z kolei doprowadziło do pojawienia się nowych metod ekstrakcji ciało stałe-ciecz. Trzy najbardziej znane ekstrakcje ciało stałe-ciecz to
- ekstrakcja Soxhleta,
- ekstrakcja Butta i Twisselmanna
- ekstrakcja Randalla.
Ekstrakcja Soxhleta
W 1879 roku Franz von Soxhlet opracował szklany aparat do ciągłej ekstrakcji tłuszczu. Ten tzw. Aparat Soxhleta umożliwia automatyczne przeprowadzenie kilku cykli ekstrakcji z jedną próbką.
Rozpuszczalnik jest podgrzewany do temperatury wrzenia w kolbie, po czym opary rozpuszczalnika unoszą się przez boczną rurkę do skraplacza. Tam para skrapla się, a następnie kapie do komory ekstrakcyjnej. Komora ta zawiera próbkę do ekstrakcji w celulozowej tulei. Opadający rozpuszczalnik wypełnia komorę ekstrakcyjną do wysokości kolanka pułapki. Następnie efekt syfonu ssącego powoduje przepływ rozpuszczalnika z rozpuszczonym ekstraktem do dolnej kolby. Poprzez ciągłe powtarzanie tego procesu można ostatecznie osiągnąć ilościową ekstrakcję. Po ekstrakcji rozpuszczalnik musi zostać oddzielony w oddzielnym urządzeniu, a wyizolowany tłuszcz jest suszony w celu zważenia.
W porównaniu do klasycznej ekstrakcji na gorąco, w której ekstrakcja próbki odbywa się bezpośrednio we wrzącym rozpuszczalniku, temperatura w komorze ekstrakcyjnej jest niższa, co sprawia, że proces ekstrakcji w aparacie Soxhleta jest znacznie bardziej czasochłonny. Czas wymagany do ilościowej ekstrakcji metodą Soxhleta zależy od próbki, która ma być ekstrahowana i może trwać do 8 godzin lub nawet dłużej.
I chociaż obecnie istnieją znacznie szybsze metody ekstrakcji, w których ekstrakcja próbki odbywa się ponownie bezpośrednio we wrzącym rozpuszczalniku, metoda Soxhleta jest nadal najczęściej opisywaną metodą oznaczania tłuszczu w paszach i żywności.
W ekstrakcji Butta gilza ekstrakcyjna z próbką znajduje się nad podgrzewanym rozpuszczalnikiem, co powoduje, że próbka ma bezpośredni kontakt z gorącymi oparami rozpuszczalnika. Opary unoszą się do skraplacza, gdzie skraplają się i przepływają z powrotem przez próbkę do kolby. W tym procesie próbka jest stale ekstrahowana przez opary i rozpuszczalnik, który kapie z powrotem. Ze względu na ciągły proces ekstrakcji w wyższych temperaturach, próbkę można zazwyczaj całkowicie wyekstrahować w ciągu kilku godzin.
Po zakończeniu ekstrakcji rozpuszczalnik jest usuwany z wyekstrahowanego tłuszczu poprzez destylację, a następnie suszenie próżniowe, a wyekstrahowany tłuszcz jest ważony. Ekstraktor Twisselmanna (po prawej) - dalsze rozwinięcie rurki Butta - ma również zawór odcinający do oddzielania rozpuszczalnika między naczyniem na próbkę a skraplaczem. Po zakończeniu ekstrakcji zawór odcinający może zostać zamknięty, a rozpuszczalnik odzyskany.
Ekstrakcja Randalla
Zasada ekstrakcji Randalla łączy szybkość ekstrakcji na gorąco z wydajnością ekstrakcji Twisselmanna lub Butta. Zasada ta jest również stosowana w SOXTHERM i została przedstawiona schematycznie na poniższym rysunku:
W pierwszym etapie gilzę ekstrakcyjną zawierającą próbkę umieszcza się bezpośrednio we wrzącym rozpuszczalniku (1). Dzięki temu duża część tłuszczu może zostać wyekstrahowana bardzo szybko – zwykle w ciągu 30 minut. W drugim etapie poziom rozpuszczalnika obniża się tak, aby tuleja z próbką nie był już zanurzona w ciekłym rozpuszczalniku (2). Zapobiega to równowadze rozpuszczonego tłuszczu pomiędzy próbką a rozpuszczalnikiem. W trzecim etapie próbkę ekstrahuje się w parach gorącego rozpuszczalnika lub przez kapiący rozpuszczalnik (3). Czas trwania drugiej fazy ekstrakcji zależy w dużej mierze od rodzaju próbki, ale zwykle wynosi około 1 godziny. Po zakończeniu drugiej fazy ekstrakcji rozpuszczalnik dalej odparowuje się i odzyskuje (4). Oznacza to, że można go ponownie wykorzystać, co nie tylko oszczędza zasoby, ale także koszty. W końcowej fazie można przeprowadzić delikatne suszenie (5). Cała ekstrakcja trwa zwykle około 2 godzin, czyli znacznie szybciej niż klasyczny proces Soxhleta.
Ekstrakcja ciecz-ciecz
Zasada ekstrakcji ciecz-ciecz opiera się na różnej rozpuszczalności dwóch niemieszających się rozpuszczalników. Zwykle stosuje się do tego rozpuszczalnik polarny (np. eter dietylowy) i rozpuszczalnik niepolarny (np. eter naftowy). Ekstrakcja próbki przebiega wówczas zgodnie z zasadą „podobne rozpuszcza się w podobnym”: polarne składniki próbki rozpuszczają się w polarnym rozpuszczalniku, podczas gdy niepolarne składniki rozpuszczają się w niepolarnym rozpuszczalniku. Przykładami konwersji opartych na aparaturze są rozdzielacz lub kolba Mojonniera.
SFE – Ekstrakcja płynem nadkrytycznym
W ekstrakcji płynem nadkrytycznym (SFE) środek ekstrahujący jest oddzielany od matrycy próbki przy użyciu płynów nadkrytycznych jako rozpuszczalnika ekstrakcyjnego. Ekstrakcję zwykle przeprowadza się ze stałej matrycy próbki, ale można ją również przeprowadzić z próbek płynnych. SFE można stosować zarówno jako etap przygotowania próbki do celów analitycznych, jak i na większą skalę. Stosuje się ją albo w celu usunięcia niepożądanych substancji z produktu, np. kawy bezkofeinowej, albo w celu uzyskania pożądanego produktu, np. ekstrakcji olejków eterycznych.
Dwutlenek węgla (CO2) jest najczęściej stosowaną cieczą nadkrytyczną, czasami modyfikowaną rozpuszczalnikami Co, takimi jak etanol lub metanol. Warunki ekstrakcji nadkrytycznego dwutlenku węgla przekraczają temperaturę krytyczną 31 °C i ciśnienie krytyczne 74 bary. W tych warunkach CO2 zachowuje się jak ciecz i dlatego można go stosować jako rozpuszczalnik do rozpuszczania rozpuszczalnych składników z matrycy próbki. Po tym procesie ekstrakt przywraca się do normalnych warunków, po czym CO2 ulega ulatnieniu i usunięciu.
